AQUAR的花园

上回讲到自立更生，实现温饱，在那以后的一个月里，每每坐在回家的校车上，最经常思考的问题就是，晚上整个啥菜哩。。。与经典的学习曲线对应，那一个月里厨艺也可谓突飞猛进，闲话少说，上几个王道

可以看到，同样是土豆丝，不论刀工还是火候，半个月前的初级产品都已不可同日而语
值得肯定的是，我那重可防身的铸铁锅至此充分派上用场，配以这边稀有的明火灶，我的热情就像滚油里的花椒香气一样泛滥
只有想不到，没有做不到，只要我的记忆中存在过的，都在我脑海里演练了一遍
不过那个时候还是专攻炒菜的，毕竟这是师父说的川菜之精华
知道了炒肉的首选是里脊，糖醋排骨不能等糖全化，土豆丝要先泡够醋，虾仁和腰果要冷油凼熟
那无师自通，比做实验的时候强多了啊！

不过，某日在我自我陶醉之后，偶然翻出师父木耳炒肉一张，不得不承认，差距还是很明显滴
那里脊肉像纸一样在筷子间抖动的奇景，在LA仍然是一个传说


有差距才有动力，虽然炒肉始终不能复制经典，我广泛的尝试中还是不乏亮色的，
附送本时期得意之作：麻婆豆腐，宫保鸡丁


师父说：这是你做的？！
我心甚慰！

A human 5'-tyrosyl DNA phosphodiesterase that repairs topoisomerase-mediated DNA damage 

www.nature.com/doifinder/10.1038/nature08444

听BY说起这篇paper，马上下来看了，作个读书笔记。

One sentence bstract

The enzyme TTRAP acts as a 5’-tyrosyl DNA phosphodiesterase to liberate the DNA 5’ phosphate termini from trapped topoisomerase, thus repair the topoisomerase-mediated DNA damage.

Background

Topoisomerases regulate DNA topology, and the activity involves the transient cleavage of DNA, If occurring near sites of endogenous DNA damage or in the presence of topoisomerase poisons, the procedure can result in abortive topoisomerase-induced DNA strand breaks. These breaks feature covalent linkage of the enzyme to the DNA termini by a 3’- or 5’-phosphotyrosyl bond.

Tdp1 (tyrosyl-DNA phosphodiesterase 1): an enzyme that cleaves 3’-phosphotyrosyl bonds and free DNA termini.

However, an enzyme cleaves 5’-phosphotyrosyl bonds have never been reported before.

TTRAP(TRAF and TNF receptor-associated protein): Little is known about function.A putative member of the Mg21/Mn21-dependent phosphodiesterase superfamily, with the DNA repair protein apurinic/apyrimidinic (AP) endonuclease-1 (APE-1, also known as APEX1) being its closest relative.

Major material

S. cerevisiae  tdp1Δrad1Δ:     This strain lacks not only Tdp1 (tyrosyl-DNA phosphodiesterase 1) but also Rad1-Rad10 nuclease, which in yeast provides an alternative (endonucleolytic) pathway for removing Top1 from 3’-termini. Thus it is hypersensitive to CPT——a topoisomerase I (Top1) poison used in this study that induces single-strand breaks (SSBs) with Top1 covalently linked to the 3’-terminus.

Recombine protein TDP1, APE1, TTRAP, and mutants of two predicted catalytic residues of TTRAP: TTRAP (E152A) and TTRAP(D262A)

Established substrate for TDP1：the purified proteins with a radiolabelled oligonucleotide duplex containing a nick with a single tyrosine covalently linked to the 3‘-terminus by a phosphotyrosyl bond.  (see attached graph)

Hypothesized substrate for “5’-TDP”： a radiolabelled oligonucleotide duplex containing a DSB with a single tyrosine covalently linked to the 5‘-terminus by a phosphotyrosyl bond.  (see attached grahp)

Methods and Results

1. TTRAP restored the resistance of tdp1Δrad1Δ against CPT（see attached graph）

2. TTRAP cleaved the 5’-phosphotyrosyl bonds in vitro

+   indicates a success cleavage ；-      indicates failure of cleavage ；

*   indicates the phenomena is only observed with a relatively high concentration of enzyme

Recombine protein	Substrate for TDP1(with 3’-tyrosyl)	Substrate with 5’-tyrosyl
TDP	+	-
APE1	-	-
TTRAP  wt	+*	+
TTRAP(E152A)	-	-
TTRAP(D262A)	-	-

3. The 5’-TDP activity was reduced in TTRAP-deficient human cell extracts.

A549 cellular extracts	5’-tyrosyl substrate
Wt	+
TTRAP depleted with shRNA	-
TTRAP depleted and restored by transient transfection of TTRAP(wt)	+
TTRAP depleted and restored with TTRAP(E152A)	-
TTRAP depleted and restored with TTRAP(D262A)	-

4. TTRAP increase etoposide resistance of yeast and TTRAP-depletion increases accumulation of etoposide-induced DSBs       *etoposide——a TopII poison           

Conclusion

Human TTRAP is a 5’-tyrosyl DNA phosphodiesterase that is required for efficient repair of Top2-induced DNA double-strand breaks.

对这篇文章这么感兴趣当然是因为TTRAP，徐师兄的文章还在这里被引用了（赞一记~嘻嘻）。我们同样曾经考察TTRAP可能存在的磷酸二酯酶活性，但是融合的GST tag可能影响了其活性，并且更关键的是底物的选择（这个小潘最有发言权）。如此文中言，即使是对通过Top1 poison造成的3’-酪氨酰磷酸二酯键，TTRAP的酯酶活性也是很低的，而这篇文章的出众之处正是在于，它大胆地假设了一个前无报道的5’-酪氨酰磷酸酯酶活性并为此设计了特异底物。所谓一把钥匙开一把锁，的确他们找到了TTRAP这把钥匙能开的锁。DNA damage repair，博大精深啊。

不过，有个问题我一直没搞明白，这个3’-tyrosyl phosphodiester长啥样啊，TDP1切的是哪个键啊，从文章中看切了剩下的有个3’-P，但不是叫磷酸二酯酶么？？呼唤生化达人知道的解答一下。

attached graph

终于看了风声，可能是之前太期待，并且被剧透的太多，看完之后我居然只有一个感觉，雷。。。
以下是我现在也没明白的地方：
　　
major concerns
1. 一句褂尾要到百草堂就能暗杀？总得安排个人进去送粉蒸鸡吧，暗杀者只认彩票不需要自己考察环境准备人员么？没有消息再跟进那个大雪天还会有人去？
2. 老鬼受老枪指挥，那老鬼发百草堂情报老枪到底知不知道？如果知道，周迅为所谓“假情报是我传出的”负什么责，如果不知道，周迅哪来的权力？（话说从头到尾 我就没看出老枪有指挥过老鬼，基本完全是老鬼在想怎么干就怎么干，然后张涵予就忽然来一句，我就是老枪。这。。。至少得有个接头暗号吧。。。）
3. 周迅家里干实业，老爸捐了架飞机，有钱人家女儿干什么不好，捐飞机进情报处？是想说老爸是铁杆汉奸还是铁杆共党？如果是前者，周迅这巨大的思想转变打哪儿来的？如果是后者，周迅凭什么决定是花飞机钱打入情报处的她重要还是执行暗杀的人重要？（看起来周迅跟家里人感情还挺好的，那个要打回家的电话是想干什么？ 也是情报的一种，结果没送出去？）
　　
minor flaws
1. 李冰冰被塑造为专业知识女性，作为专业的特务人员，只因为爱话剧刘，就会把情报告诉他，弥补周迅不知道的情报（那应该已算相当机密的了）？
2. 戏曲调子传情报，内衣传情报。。。且不论这可行性吧。。。如果没有医务人员接头怎么办？如果死人直接扔海里怎么办？如果我们的内线都遍布伪医院、后勤了（并且这些人还正好被调到跟裘庄相关的班组），周迅和张涵予还辛苦什么？干脆直接其实看门的士兵也是内线好了
3. 张涵予给了周迅一支烟，被子里的一包三炮台是哪儿来的？注意周是直接从舞厅到裘庄的，谍报人员已经神到想有啥道具就有啥道 具，真的不用大义凌然了。
　　
总的来说，跟《潜伏》差太远了。
视觉效果不错，演员表现很好，但故事内容。。。我理解电影要在两个小时里面抖清楚一个包袱不容易的，但这并不等于可以没有逻辑。。。
　　
最后，这个电影应该标明少儿不宜。
真的很汗。

因为对宫的关系，天蝎座与牛行事截然相反，却又是牛在12宫中有特殊渊源的星座
反之亦然。
于是我今天发现，这个月里对我特别的生日是最多的，纵使天各一方，天涯相忘。
都是蝎子，却个性迥异，共同的一点，都是记忆里特别的况味。

10.29   最温柔、善良的天蝎，你的典型是天蝎的非典型，却也非典型得那么极端，一如天蝎的决绝。看似没脾气的你，却永远在作出真实勇敢的决定。一次次分别的泪水，把你深深的烙印在我的心底。估计你这家伙看不到吧，我们一定还会再见面的！

11.1    这是一个精确的180度对位，我想只能说我们的头真的都很圆吧！虽然两个人都犟起来的时候真的很胸闷，但我意识到这不仅仅是记忆中的况味，还将是我今后继续与之斗争的主题-，-那么，只有化思念，悲愤，不服气...为力量了，加油！（这是对我自己说的）还是要送上生日祝福，继续发扬你稳准冷（狠就算了，要和谐）的天蝎精神，没有你到不了的地方。ps：三个光棍，真是一个寂寞的生日。

11.11   原来还有更寂寞的生日...现在回想起当时种种，那些年少轻狂如大桥下飞舞的纸屑，在黑水上一边闪闪发亮，一边渐行渐远。如今我已早不是当年那个小妞，你的声气却泛着一如以往的不管不顾，异想天开。我是该劝你醒醒呢,还是笑着看你继续梦蝶呢？我想了想，还是后者吧，我非鱼，安知鱼乐？

11.19   天蝎射手是变革的交界，你的坚韧和勇敢都在证明这一点。tk到你也已经找到自己的幸福，珍重，祝好!

牙尖完毕，干活。这个月不再上space。

And there come three impressive things:
First, LA rains,for two days!
Second, LA River floods, the whole concrete、graffiti-painting-covered riverbed is filled with running water.
Third, my U.V. sensitive glasses turn as dark as usual when it is raining cats and dogs outside...

现在还记得《撒哈拉故事》中的很多情节，从第一个故事《中国餐馆》，到最后一个《白手成家》。

后者可谓代表了我心目中家装的最高境界，然而真到了自己身上，金牛座的实用精神还是直接战胜了yy已久的浪漫情怀。首先选了一个有壁橱的房间，衣箱书本杂物统统请君入墙；然后从IKEA背回两把椅子， 一张桌子，超重跨越太平洋的书架信件盒甚至鼠标垫一一派上用场；在成功与比我还拖拉的墨西哥gg拉锯近一个星期，终于抱得价廉物美queen size美床归时，这白手成窝的工程已经基本大功告成了。

然而无论是出于浪漫情怀还是实用精神，或者就直接是金牛座不容怠慢的胃，这个吃饭问题总是马虎不得的。在离开SF的时候，师父在忍痛吃过形同肉泥的丸子汤，变成炸土豆饼的炒土豆丝和见识了完全基于yy的蒸凉面之后，仰天长叹。。。良久，才缓缓说道：到了LA，我们先在中国超市多买点面，面总是会下的吧。。。

于是就带着先主攻面食的觉悟南下了。朋友把我们先接到学校旁边他的家里，pp小主妇正在厨房忙碌，见我们来了巧笑倩兮，说，你们那么远来，也没什么好菜，真是不好意思~先坐会，喝点丸子汤，吃点小菜，卤鸡爪，等我弄好这个麻婆豆腐，还有一个红烧肉再焖一下就好，你们等等啊。。。。。。我那叫一个崇拜啊！在朋友家住了5、6天，除了找房子买家具，我的记忆中就是一道道销魂的菜，早上的鲜豆浆，中午的麻油鸡，晚上的水晶蒸饺，天天不重样。师父曲逢知音，意气风发，客场表演出高水平川香鱼和糖醋排骨，余味绕梁，三日不绝。在这小小厨房里虔诚地洗盘子递酱油的我，一边仰望先贤一边默默发愁，就快要自己开伙了，吃啥捏。。。

然而第一次总是要来的。在装好床垫，正式入住我冬冷（推测的）夏热的小窝的第一天，我就勇敢地走入了厨房。这里要声明一下，我是不会做饭，但是作为一个中国人，一个四川人，偶是有气节滴。什么pizza，hamburger，sandwich之流，从来就没入过偶的眼，偶仰慕的是师父那运筹帷幄，指点厨房的气势。幸好师父忧心切切，走前把调料和冰箱装备得很齐全，基本在我有限的知识里，做点饲料所需的东西都有了。打开冰箱，从师父的木耳炒肉到pp小主妇的合子饼，一道道美食在我脑中一一闪过，然后又被我一一否决了。师父说得好，做饭是一种态度。做不好没关系，不能浪费材料啊！这时，我想起了前几天谈笑中的一个反面教材，然而它应该在我的能力handle之内吧，至少不会浪费原料。好，第一次嘛，不能急于求成，就这样吧！

会读到这个blog的都是高手，这种水平的菜我也就没必要细细描述过程了，anyway，这个耗时一小时的鸡翅膀+西兰花+鸡汁西兰花汤让我激动不已，四川人的血液在我心中沸腾，事实证明，中国人民是有自主研发的能力滴！

写不动了，下回再写，附同期初级作品一二，博君一笑~



最后ps一下：高手都是要看资质收徒弟的，所以这个师父之称只是代表愚顽如我的心神往之。以上作品，概不代表师门水平~
谢谢观赏~~